Browsing tag: identyfikacja

ZASTOSOWANIE TECHNIKI MALDI-TOF MS DO IDENTYFIKACJI DERMATOFITÓW

APPLICATION OF THE MALDI-TOF MS TECHNIQUE FOR IDENTIFICATION OF DERMATOPHYTES
S. Gnat, D. Łagowski, A. Nowakiewicz

Streszczenie: Metoda MALDI-TOF MS jest nowym i coraz częściej wykorzystywanym w laboratoriach klinicznych narzędziem do identyfikacji drobnoustrojów. Szerokie zainteresowanie tą metodą wynika z jej wysokiej dokładności, szybkości uzyskiwania wyników identyfikacji mikroorganizmów oraz stosunkowo niskiego kosztu analiz. Implementacja tej techniki do identyfikacji dermatofitów jest jednak trudna. Trudności te spowodowane są naturalną złożonością biologiczną grzybów strzępkowych, bardzo wolnym tempem wzrostu drobnoustrojów i częstym wytwarzaniem pigmentów. Ponadto, identyfikacja dermatofitów tą techniką stanowi wyzwanie ze względu na brak jasnej definicji gatunku dla niektórych taksonów lub w obrębie niektórych kompleksów gatunkowych. Przegląd literatury naukowej wskazuje, że wiarygodność identyfikacji dermatofitów opartej na MALDI-TOF MS waha się między 13,5 a 100%. Liczne czynniki krytyczne związane z rutynowymi procedurami laboratoryjnymi, tj. rodzajem podłoża hodowlanego, czasem inkubacji, techniką ekstrakcji białek, typem urządzenia czy wersją biblioteki widm referencyjnych, warunkują taką zmienność w uzyskiwanych wynikach. Pomimo wielu ograniczeń metoda MALDI-TOF MS stanowi istotny postęp techniczny w diagnostyce mykologicznej i alternatywę dla czasochłonnej i pracochłonnej identyfikacji dermatofitów opartej o cechy morfologiczne oraz sekwencjonowanie DNA. Niemniej jednak zanim zostanie wdrożona do rutynowych badań diagnostycznych, konieczne jest rozszerzenie biblioteki widm referencyjnych dermatofitów, a także opracowanie procedur analizy bezpośredniej z próbek dermatologicznych.
1. Wprowadzenie.
2. Identyfikacja drobnoustrojów z zastosowaniem metody MALDI-TOF MS. 3. MALDI TOF MS w diagnostyce mykologicznej. 4. Czynniki krytyczne identyfikacji dermatofitów metodą MALDI-TOF. 4.1. Wpływ stosowanego podłoża mikrobiologicznego. 4.2. Wpływ czasu inkubacji. 4.3. Wpływ procedury ekstrakcji białek i przygotowania matrycy. 4.4. Wpływ stosowanych urządzeń do spektrometrii masowej. 4.5. Wpływ biblioteki widm referencyjnych. 4.6. Wpływ algorytmu porównywania widm. 4.7. Wpływ zmian taksonomicznych. 5. Perspektywy rozwoju MALDI-TOF MS w diagnostyce mykologicznej. 6. Podsumowanie


Abstract: The MALDI-TOF MS method is a new technique, which is being increasingly used in clinical laboratories for identification of microorganisms. The wide interest in this method has been aroused by its high accuracy, instantaneous identification results, and relatively low cost of analyses. However, the application of this technique for identification of dermatophytes poses difficulties. They are caused by the natural biological complexity of filamentous fungi, very slow growth of cultures, and frequent production of pigments. Furthermore, identification of dermatophytes with this technique is a challenge due to the lack of a clear species definition for some taxa or within certain species complexes. A review of scientific literature indicates that the reliability of identification of dermatophytes based on MALDI-TOF MS is in the range between 13.5 and 100%. This variability is determined by many critical factors associated with routine laboratory procedures, i.e. the type of culture medium, incubation time, protein extraction technique, type of device, or version of the reference spectrum library. Despite these numerous limitations, the MALDI-TOF MS method is part of the significant technical progress in mycological diagnostics and an alternative to the time-consuming and labor-intensive identification of dermatophytes based on morphological traits and DNA sequencing. Nevertheless, before the technique can be implemented into routine diagnostic tests, it is necessary to expand the reference spectra library and develop procedures for direct analysis of dermatological samples.
1. Introduction. 2. Identification of microorganisms using the MALDI-TOF MS method. 3. MALDI TOF MS in mycological identification. 4. Critical factors in identification of dermatophytes with the MALDI-TOF method. 4.1. Impact of the microbiological medium. 4.2. Impact of the incubation time. 4.3. Impact of the protein extraction procedure and preparation of the matrix. 4.4. Impact of the mass spectrometry apparatus. 4.5. Impact of the reference spectrum library. 4.6. Impact of the spectrum comparison algorithm. 4.7. Impact of taxonomic changes. 5. Prospects for the development of MALDI-TOF MS in mycological diagnostics. 6. Summary

MOLEKULARNE METODY DIAGNOSTYKI DERMATOMYKOZ – PRZEGLĄD DOSTĘPNYCH TECHNIK ORAZ OCENA ICH ZALET I WAD W IMPLEMENTACJI DO RUTYNOWEGO STOSOWANIA

MOLECULAR METHODS FOR DIAGNOSTICS OF DERMATOMYCOSES – REVIEW OF AVAILABLE TECHNIQUES AND EVALUATION OF THEIR ADVANTAGES AND DISADVANTAGES IN IMPLEMENTATION FOR IN ROUTINE USE
Sebastian Gnat, Dominik Łagowski, Aneta Nowakiewicz, Mariusz Dyląg

DOWNLOAD PDF FILE

Streszczenie: Infekcje grzybicze skóry, włosów i paznokci stanowią najliczniejszą i najbardziej rozpowszechnioną grupę wszystkich grzybic. Czynnikami etiologicznymi większości grzybiczych infekcji powierzchownych są dermatofity, które, pomimo że są najstarszymi mikroorganizmami uznanymi za czynniki chorobotwórcze, długo nie doczekały się stabilnego systemu taksonomicznego. Z diagnostycznego punktu widzenia, identyfikacja gatunkowa dermatofitów wciąż stanowi poważny problem w postępowaniu identyfikacyjnym, z czego wynikają częste błędy terapeutyczne. Wzrastająca liczba zakażeń, w tym również odzwierzęcych, brak stabilności taksonomicznej i niejednoznaczny obraz kliniczny wszystkich przypadków dermatomykoz powodują konieczność poszukiwania nowych metod szybkiej, taniej i powtarzalnej identyfikacji gatunkowej tych grzybów. Ostatnia dekada stanowi rewolucyjny czas opracowywania molekularnych metod diagnostyki i identyfikacji gatunkowej czynników etiologicznych powodujących te dermatomykozy. Wyniki wielu badań wskazują, że bezpośrednia identyfikacja grzybów z próbek dermatologicznych w oparciu o metody molekularne jest o wiele bardziej wiarygodna i znacznie szybsza w porównaniu z prowadzoną metodami konwencjonalnymi. Niejednokrotnie, identyfikowano też czynnik etiologiczny obserwowanych zmian, podczas gdy wynik hodowli był negatywny. Poszczególne metody molekularne stosowane w identyfikacji gatunkowej grzybów bezpośrednio z materiału klinicznego różnią się sposobami ekstrakcji DNA genomowego, zastosowanymi technikami PCR, wykorzystywanym markerem molekularnym oraz systemem interpretacji wyników. W niniejszej pracy dokonano przeglądu literatury traktującej o różnych metodach diagnozowania grzybic powierzchniowych opartych o techniki biologii molekularnej, o ich zaletach i ograniczeniach, a także o czynnikach krytycznych dla ich implementacji do rutynowego stosowania. Stanowisko mikrobiologów wydaje się być jednoznaczne, czas, kiedy diagnostyka molekularna zastąpi konwencjonalne techniki oparte na hodowli dermatofitów i ocenie ich morfologii, nieubłaganie nadchodzi. Molekularne metody identyfikacji czynników etiologicznych dermatomykoz bezpośrednio z próbek dermatologicznych są zdecydowanie bardziej atrakcyjne i mają wiele zalet.

1. Wprowadzenie. 2. Znaczenie identyfikacji gatunkowej dermatofitów w próbkach dermatologicznych. 3. Molekularna identyfikacja gatunkowa czystych kultur dermatofitów. 4. Metody bezpośredniej identyfikacji grzybów z prób klinicznych. 4.1. Izolacja DNA. 4.2. Techniki bezpośredniej identyfikacji oparte na klasycznym PCR. 4.3. Techniki bezpośredniej identyfikacji oparte na PCR w czasie rzeczywistym. 5. Wybór optymalnej metody do stosowania rutynowego. 6. Zalety i wady molekularnych metod identyfikacyjnych stosowanych w mykologii. 7. Podsumowanie

Abstract: Fungal infections of the skin, hairs, and nails undeniably dominate among all types of fungal infections. The etiological factors of the majority of superficial fungal infections are dermatophytes which, although they are the oldest microorganisms considered as pathogens, have long been unstable in the taxonomic position. From a diagnostic point of view, the species identification of dermatophytes is still a serious problem, often generating therapeutic errors. An increasing number of infections, including zoonoses, lack of taxonomic stability and ambiguous clinical picture of all cases of dermatomycosis induce to search for new, fast, repeatable and at the same time cheap methods of species identification of these fungi. In the last decade, revolutionary progress has been observed in the development of molecular methods for the diagnosis of fungal infections and the reliable identification of species of etiological factors that cause these dermatomycoses. The results of many studies indicate that the direct identification of fungi from dermatological samples based on molecular methods is much more reliable and much faster compared to that carried out by conventional methods. Often, the etiological factor of the observed changes was also identified, while the result of cultivation was negative. Particular molecular methods used in the species identification of fungi directly from the clinical material differ in the procedures of genomic DNA extraction, PCR techniques used, the molecular marker used and the results interpretation system. This paper reviews literature regarding different methods of diagnosing of superficial fungal infections based on molecular biology techniques, their advantages and limitations, as well as critical factors for their implementation for routine use. The position of microbiologists in this matter seems to be a foregone conclusion, the time when molecular diagnostics will replace the conventional techniques, based on the cultivation of dermatophytes and assessing their morphology, inexorably coming. Molecular methods of identifying aetiological factors of dermatomycoses directly from dermatological samples are much more attractive and have many advantages.

1. Introduction. 2. Importance of identification of dermatophyte species in dermatological samples. 3. Molecular species identification in pure dermatophyte cultures. 4. Methods for direct identification of fungi from clinical samples. 4.1. DNA isolation. 4.2. Classical PCR-based techniques of direct identification. 4.3. Real-time PCR-based techniques of direct identification. 5. Choice of an optimal method for routine use. 6. Advantages and drawbacks of molecular identification methods applied in mycology. 7. Summary

Molekularne metody identyfikacji bakterii z rodzaju Staphylococcus

Molecular methods for the identification of bacteria from the genus Staphylococcus
E. Szczuka, N. Makowska, A. Kaznowski

1. Wprowadzenie. 2.1. Różnicowanie gatunków na postawie sekwencji 16S rDNA. 2.2. Wykorzystanie polimorfizmu międzygenowego 16S rRNA i 23S rRNA do identyfikacji gronkowców. 2.3. Identyfikacja gronkowców na podstawie sekwencji oraz analizy restrykcyjnej genu gap. 2.4. Sekwencja genu hsp60 jako marker genetyczny stosowany w klasyfikacji i identyfikacji gronkowców. 2.5. Polimorfizm genu dnaJ wykorzystany w identyfikacji Staphylococcus spp. 2.6. Różnicowanie gatunków gronkowców na podstawie sekwencji genu tuf. 2.7. Diagnostyka gatunków gronkowców w oparciu o polimorfizm genu sodA. 2.8. Identyfikacja na postawie sekwencji genu rpoB. 3. Zastosowanie reakcji PCR w czasie rzeczywistym w diagnostyce gronkowców. 4. Wykorzystanie spektrometrii mas w identyfikacji gronkowców. 5. Podsumowanie

Abstract: Staphylococci are increasingly recognized as etiological agent of many opportunistic human and animal infections, indicating the need for rapid and accurate identification of these bacteria. In recent years, a significant progress in the identification and phylogenetic studies of Staphylococcus species has been made. In this paper we describe several molecular methods used in taxonomy and identification of staphylococci. The analysis of 16S rRNA gene, gap gene (coding for glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), hsp60 gene (encoding heat shock protein Hsp60), dnaJ gene (encoding heat shock protein Hsp40), tuf gene (encoding elongation factor Tu), sodA gene (encoding superoxide dismutase), ropB gene (encoding the beta subunit of RNA polymerase) has been used as tool for the identification of Staphylococcus isolates. Besides the sequence analysis, the PCR-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) analysis of core genes (16S rRNA, gap, hsp60, dnaJ, tuf) has been described. Attention is also paid to new molecular methods such as real-time PCR and mass spectrometry.

1. Introduction. 2.1. Differentiation of staphylococcal species based on 16S rRNA gene sequence. 2.2. Use of the polymorphism of the 16S-23S rRNA spacer for staphylococci identification. 2.3. Identification of staphylococci using the sequence and restriction fragment length polymorphism analysis of gap gene. 2.4. The sequence of the hsp60 gene as a marker for classification and identification of staphylococci. 2.5. Use of polymorphism of dnaJ gene for the identification of Staphylococcus spp. 2.6. Differentiation of staphylococcal species based on tuf gene sequence. 2.7. Use of the polymorphism of sodA gene in diagnostics of staphylococcal species. 2.8. Identification based on ropB gene sequence. 3. Application of real-time PCR in diagnostics of staphylococci. 4. Application of mass spectrometry in the identification of staphylococcal isolates. 5. Summary

Grzyby z rodzaju Scopulariopsis – mało znane patogeny człowieka

Fungi of the genus Scopulariopsis – ill-defined human pathogens
M. Skóra, J. Bielecki, M. Bulanda, A. B. Macura, T. Jagielski

1. Wprowadzenie. 2. Pozycja taksonomiczna. 3. Morfologia. 4. Występowanie. 5. Znaczenie w medycynie człowieka. 5.1. Grzybice skóry i paznokci. 5.2. Inne postacie zakażeń. 6. Diagnostyka zakażeń. 7. Wrażliwość na leki przeciwgrzybicze. 8. Leczenie. 9. Podsumowanie. 10. Piśmiennictwo

Abstract: The genus Scopulariopsis accommodates more than 30 species of mitosporic moulds. Their natural habitat is the soil, where they live as saprophytes and are involved in the decomposition of organic matter. However, some members of the Scopulariopsis genus may cause opportunistic infections in humans. Superficial skin lesions and onychomycosis in particular are the most predominant clinical manifestations. Much rarer are subcutaneous, deep tissue and disseminated infections, most of which occur in immunocompromised individuals and are associated with high mortality. Treatment of Scopulariopsis infections is difficult and usually empirically-based, one reason for this being resistance of Scopulariopsis spp. to a broad spectrum of antifungal agents. Identification of pathogenic Scopulariopsis spp. still largely relies on the phenotype-based methods, employing both morphological and biochemical criteria. These methods require highly qualified personnel and are usually considered as slow and laborious, often leading to misidentification. Therefore, molecular diagnostic methods are preferred, since they provide rapid, high-throughout, unambiguous and highly specific identification of fungal pathogens. Earlier attempts to develop assays for detecting Scopulariopsis spp. resulted in limited success. These assays, almost exclusively based on the hypervariable regions of the large subunit (LSU) rRNA, often produce inconclusive results and, more importantly, lack specificity, being unable to discriminate between different Scopulariopsis spp. Hence, currently available molecular methods do not allow inter- and intra-species differentiation of Scopulariopsis fungi.

1. Introduction. 2. Taxonomic position. 3. Morphology. 4. Distribution. 5. Significance in human medicine. 5.1. Skin and nail mycoses. 5.2. Other forms of infections. 6. Diagnosis of infections. 7. Antifungal susceptibility. 8. Treatment. 9. Summary. 10. References

Staphylococcus pseudintermedius – trudno rozpoznawalny patogen

Staphylococcus pseudintermedius – a pathogen difficult to identify
M. Kizerwetter-Świda, D. Chrobak-Chmiel, M. Rzewuska, M. Binek

1. Wstęp. 2. Grupa Staphylococcus intermedius (SIG, Staphylococcus intermedius group). 3. Występowanie S. pseudintermedius. 4. Potencjał zoonotyczny S. pseudintermedius. 5. Identyfikacja. 6. Typowanie genetyczne. 7. Wykrywanie oporności na meticylinę u szczepów S. pseudintermedius – metody fenotypowe. 8. Wykrywanie oporności na meticylinę u S. pseudintermedius – metody genotypowe. 9. S. pseudintermedius – oporność na antybiotyki i chemioterpautyki. 10. Podsumowanie

Abstract: Staphylococcus pseudintermedius has recently been described as a member of the Staphylococcus genus. Three closely related staphylococci (Staphylococcus pseudintermedius, Staphylococcus intermedius and Staphylococcus delphini) with very similar phenotypic characteristics form the S. intermedius group (SIG). In fact, majority of strains previously recognized as S. intermedius isolated from dogs were reclassified to the species S. pseudintermedius. Within the SIG, S. pseudintermedius represents the major pathogenic species and is involved in a wide variety of infections, mainly in dogs, but also in other animal species and humans. Recently, an increase has been observed in the frequency of infections caused by methicillin-resistant S. pseudintermedius (MSRP) in animals, especially in dogs and humans. The identification of S. pseudintermedius in veterinary laboratories is usually not difficult, however, in laboratories working with materials collected from people the risk of misidentification is high. Moreover, the demonstration of the mecA gene may be a challenge in diagnostic laboratories. The objective of this review is to summarize the current knowledge of Staphylococcus pseudintermedius, including MRSP, with the emphasis on taxonomy, occurrence and diagnostics. Furthermore, this review present also the genetic basis of antimicrobial resistance in S. pseudintermedius.

1. Introduction. 2. Staphylococcus intermedius group (SIG) 3. The occurrence of S. pseudintermedius. 4. Zoonotic potential of S. pseudintermedius. 5. Identification. 6. Genetic typing. 7. Detection of methicillin resistance in S. pseudintermedius – phenotypic methods. 8. Detection of methicillin resistance in S. pseudintermedius – genotypic methods. 9. S. pseudintermedius – resistance to antimicrobials. 10. Summary

POSTĘPY MIKROBIOLOGII 2020, 59, 2

POSTĘPY MIKROBIOLOGII 2020, 59, 2

POSTĘPY MIKROBIOLOGII
2020, 59, 2

O Towarzystwie

PTM

Celem Polskiego Towarzystwa
Mikrobiologów jest propagowanie rozwoju nauk mikrobiologicznych

i popularyzowanie osiągnięć
mikrobiologii wśród członków Towarzystwa oraz szerokich kręgów społeczeństwa. Formami działalności jest organizowanie zjazdów, posiedzeń naukowych, kursów, wykładów
i odczytów oraz konkursów prac naukowych; wydawanie i popieranie wydawania czasopism naukowych, książek
i innych publikacji
z dziedziny mikrobiologii; opiniowanie o stanie i potrzebach mikrobiologii polskiej

i występowanie w jej sprawach wobec
władz państwowych; współpraca
z pokrewnymi stowarzyszeniami
w kraju i za granicą.